First molecular detection of Haemoproteus spp. and Plasmodium spp. in eared doves (Zenaida auriculata) in Brazil / Primeira detecção molecular de Haemoproteus spp. e Plasmodium spp. em pombos (Zenaida auriculata) no Brasil

Abstract The aim of this study was to verify the presence and identify the species of haemosporidian parasites in eared doves (Zenaida auriculata) in Brazil. Two hundred and eleven male and female eared doves were trap-captured in four different regions of Londrina city, in southern Brazil. Whole blood was collected in EDTA tubes through heart puncture after euthanasia in a CO2 chamber. A nested PCR targeting the mitochondrial cytochrome b gene (cyt b) of Haemoproteus spp./Plasmodium spp. was performed, followed by an enzymatic digestion to identify the genus. Phylogenetic trees were constructed to determine the closely related species. Out of 211 eared doves, 209 (99.05%) were positive for Haemoproteus spp. and/or Plasmodium spp. RFLP analysis showed that 72.72% (152/209) of eared doves were positive only for Haemoproteus spp., 6.22% (13/209) were positive only for Plasmodium spp., and 21.05% (44/209) of eared doves had mixed infections. Genetic analysis found four samples that were homologous with Haemoproteus multipigmentatus and one that was homologous with Plasmodium sp. This is the first molecular study of hemoparasites from eared doves in Brazil, and it is also the first description of H. multipigmentatus and Plasmodium spp. infection in eared doves in Brazil.

Resumo O objetivo deste estudo foi verificar a presença e a identificação espécies de parasitas hemosporídeos em pombos (Zenaida auriculata) no Brasil. Duzentos e onze pombos machos e fêmeas foram capturados em quatro regiões diferentes de Londrina, sul do Brasil. Amostra de sangue foi coletada em tubos contendo EDTA por meio de punção cardíaca, após eutanásia em câmara de CO2. Uma nested PCR com alvo no gene mitocondrial citocromo b (cyt b) de Haemoproteus spp./Plasmodium spp. foi realizada, seguida de digestão enzimática para identificar o gênero. A árvore filogenética foi construída para determinar a relação com outras espécies. Das 211 pombas, 209 (99,05%) foram positivas para Haemoproteus spp./Plasmodium spp. A análise RFLP demonstrou que 72,72% (152/209) das pombas foram positivas somente para Haemoproteus spp.; 6,22% (13/209) foram positivas somente para Plasmodium e 21,05% (44/209) das pombas tiveram infecções mistas. A análise genética mostrou quatro amostras homólogas com H. multipigmentatus e uma com Plasmodium spp. Este é o primeiro estudo molecular de hemoparasitas em pombos no Brasil. E é também a primeira descrição da infecção por H. multipigmentatus e Plasmodium spp. em pombos Z. auriculata no Brasil.

Comparative morphometric evaluation of hepatic hemosiderosis in wild Magellanic penguins (Spheniscus magellanicus) infected with different Plasmodium spp. subgenera / Avaliação morfométrica comparativa da hemossiderose hepática em pinguins-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus) de vida livre infectados por diferentes subgêneros de Plasmodium spp

Abstract Avian malaria is one of the most important diseases of captive penguins. We employed morphometric techniques to evaluate hepatic hemosiderosis in rehabilitating wild Magellanic penguins (Spheniscus magellanicus) that were negative (n = 9) or naturally infected by different subgenera of Plasmodium spp. (n = 24), according with: Plasmodium subgenera (Haemamoeba, Huffia, Other lineages, and Unidentified lineages), severity of Plasmodium histopathological lesions, and concurrent diseases, age class (juvenile or adult plumage), sex (male, female or not determined), body score (emaciated, thin, good, excellent, not available), molt, presence or absence of oil contamination upon admission, iron supplementation, and rehabilitation center. The percentage of the area occupied by hemosiderin was called 'Index of Hepatic Hemosiderosis (IHH)'. Plasmodium-positive females presented significantly higher IHH values (17.53 ± 12.95%) than males (7.20 ± 4.25%; p = 0.041). We observed higher levels of congestion (p = 0.0182) and pneumonia (p = 0.0250) severity between Unidentified lineages vs. Huffia. We believe that the hepatic hemosiderosis observed in this study was multifactorial, the result of pathological processes caused by malaria, molting, hemoglobin and myoglobin catabolism during migration, anemia, concomitant diseases, and iron supplementation, all possibly potentiated by decreased liver mass. Further studies are needed to clarify the mechanisms of these hypotheses.

Resumo Malária aviária é uma das mais relevantes doenças em pinguins cativos. Foram aplicadas técnicas morfométricas para avaliar a hemossiderose hepática em pinguins-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus ) de vida livre em reabilitação negativos (n = 9) e naturalmente infectados por diferentes subgêneros de Plasmodium spp. (n = 24), quanto a: subgênero de Plasmodium (Haemamoeba , Huffia, Outras Linhagens, e Linhagens não identificadas), severidade das lesões histopatológicas causadas por Plasmodium e doenças concomitantes, faixa etária (plumagem juvenil ou adulta), sexo (macho, fêmea, indeterminado), condição corporal (emaciado, magro, bom, excelente, indisponível), muda, presença/ausência de óleo a admissão, suplementação de ferro, e centro de reabilitação. A porcentagem da área ocupada por hemossiderina foi denominada "Índice de Hemossiderose Hepática (IHH)". Fêmeas Plasmodium -positivas apresentaram IHH significativamente mais elevado que machos, respectivamente, 17,53 ± 12,95% e 7,20 ± 4,25% (p = 0,041). Níveis mais elevados de congestão (p = 0,0182) e pneumonia (p = 0,0250) foram observados entre Linhagens não identificadas vs. Huffia. Possivelmente, a hemossiderose hepática observada nesse estudo seja multifatorial, resultado de processos patológicos causados por malária, muda, catabolismo de hemoglobina e mioglobina durante a migração, anemia, doenças concomitantes e suplementação de ferro, potencialmente intensificados por massa hepática reduzida. Estudos complementares são necessários para esclarecer os mecanismos de tais hipóteses.

Plasmodium spp. and Haemoproteus spp. infection in birds of the Brazilian Atlantic Forest detected by microscopy and polymerase chain reaction / Infecção por Plasmodium spp. e Haemoproteus spp. em aves da Mata Atlântica brasileira detectada por microscopia e reação em cadeia da polimerase

In recent years haemosporidian infection by protozoa of the genus Plasmodium and Haemoproteus, has been considered one of the most important factors related to the extinction and/or population decline of several species of birds worldwide. In Brazil, despite the large avian biodiversity, few studies have been designed to detect this infection, especially among wild birds in captivity. Thus, the objective of this study was to analyze the prevalence of Plasmodium spp. and Haemoproteus spp. infection in wild birds in captivity in the Atlantic Forest of southeastern Brazil using microscopy and the polymerase chain reaction. Blood samples of 119 different species of birds kept in captivity at IBAMA during the period of July 2011 to July 2012 were collected. The parasite density was determined based only on readings of blood smears by light microscopy. The mean prevalence of Plasmodium spp. and Haemoproteus spp. infection obtained through the microscopic examination of blood smears and PCR were similar (83.19% and 81.3%, respectively), with Caracara plancus and Saltator similis being the most parasitized. The mean parasitemia determined by the microscopic counting of evolutionary forms of Plasmodium spp. and Haemoproteus spp. was 1.51%. The results obtained from this study reinforce the importance of the handling of captive birds, especially when they will be reintroduced into the wild...

Nos últimos anos infecção por protozoários hemosporídeos dos gêneros Plasmodium e Haemoproteus, tem sido considerada um dos fatores mais importantes relacionados com a extinção e / ou declínio da população de várias espécies de aves em todo o mundo. No Brasil, apesar da grande biodiversidade aviária, poucos estudos foram desenvolvidos para detectar a infecção, especialmente entre as aves silvestres mantidas em cativeiro. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar a prevalência de infecção por Plasmodium spp. e Haemoproteus spp. em aves silvestres em cativeiro na Mata Atlântica do sudeste do Brasil, utilizando microscopia convencional e reação em cadeia da polimerase. Amostras de sangue de 119 aves mantidas em cativeiro no Ibama durante o período de julho de 2011 a julho de 2012, foram coletadas. A densidade parasitária foi determinada com base apenas em leituras de esfregaços de sangue por microscopia fotônica. A prevalência média de infecção por Plasmodium spp. e Haemoproteus spp. obtida por exame microscópico de esfregaços sanguíneos e PCR foi semelhante (83,19% e 81,3%, respectivamente), com Caracara plancus e Saltator similis sendo as espécies mais parasitadas. A parasitemia média determinada pela contagem microscópica de formas evolutivas de Plasmodium spp. e Haemoproteus spp. foi de 1,51%. Os resultados obtidos neste estudo reforçam a importância do manejo de aves em cativeiro, especialmente quando serão reintroduzidas na natureza...

Os estudos em malária aviária e o Brasil no contexto científico internacional (1907-1945) / Studies of avian malaria and Brazil in the international scientific context (1907-1945)

Aborda a contribuição de cientistas brasileiros aos estudos sobre o protozoário causador da malária. Ao colocar em foco os trabalhos de Henrique Aragão e Wladimir Lobato Paraense, destaca a importância da malária aviária para o entendimento da malária humana e sua terapêutica, a rede de relações científicas estabelecidas, as agendas comuns de pesquisa, as trocas de informações entre pesquisadores, assim como o papel por eles desempenhado no contexto internacional das descobertas científicas.

Exoerythrocytic development of Plasmodium ga llinaceum in primary fibroblast culture of chicken embryo / Desenvolvimento exoeritrocítico de Plasmodium gallinaceum em cultura primária de fibroblasto de embrião de galinha

In this study we assessed the susceptibility of primary fibroblast culture of chicken embryo to infection of P. gallinaceum sporozoites as well as the initial development of exoerithrocytic stages. Fibroblasts were obtained from the chest muscles of chicken embryos and sporozoites were obtained from experimentally infected Aedes fluviatilis salivary glands. After 1h, 3h, 24h, 48h and 72h periods pos-infection, cell cultures were fixed and analyzed both by indirect immunofluorescent-antibody test with anti-circumsporozoite protein monoclonal antibodies and by transmission electron microscopy. Circumsporozoite protein was detected in all parasitic forms. The mean percentage of fibroblasts with adhered or penetrated sporozoites did not significantly increase proportionately to the concentration of parasites in the inoculum, and independently if fetal calf or normal chicken sera were used in the culture medium. It was noted that the longer the incubation time, higher the possibility of the sporozoites to adhere and penetrate to fibroblats. Spozoites were observed penetrating in the fibroblast after 3h incubation when 0.68% of the cells had adhered parasites. Differentiation and development of the exoerythrocytic forms was observed after 24h incubation, when an average of 0,14% of the parasites have already invaded the cells. Developing parasites were found until 72h, when only 0.04% of fibroblasts were infected. Fibroblast cell culture seems to be a valuable experimental tool for in vitro investigation of the exoerytrocytic cycle of P. gallinaceum.

No presente estudo, avaliamos a susceptibilidade de cultura primária de fibroblastos de embrião de galinha à infecção por esporozoítas de P. gallinaceum, assim como o desenvolvimento de estágios do ciclo exoeritrocítico. Fibroblastos foram obtidos a partir da musculatura do peito de embriões de galinha e esporozoítas foram obtidos de glândulas salivares de Aedes fluviatilis experimentalmente infectados. Após períodos de 1h, 3h, 24h, 48h e 72h após a infecção, culturas de células foram fixadas e analisadas através de imunofluorescência indireta empregando-se anticorpos monoclonais contra a proteína circum-esporozoíta e microscopia eletrônica de transmissão. Proteína circum-esporozoíta foi detectada em todas as formas parasitárias. O percentual médio de fibroblastos com esporozoítas aderidos ou já penetrados não aumentou proporcionalmente com a concentração de parasitos no inóculo e independeu se o soro utilizado no cultivo celular era soro bovino fetal ou soro de galinha normal. Foi observado que, quando maior é o período de incubação, maior é a possibilidade dos esporozoítas aderirem e penetrarem nos fibroblastos. Esporozoítas foram observados penetrando em fibroblastos depois de 3h de incubação, quando 0,68% das células tinham parasitos aderidos. A diferenciação e o desenvolvimento das formas exoeritrocíticas foram observados após 24h de incubação, quando somente 0.04% dos fibroblastos achavam-se infectados. A cultura primária de fibroblastos de galinha parece ser um valioso modelo experimental para a investigação in vitro do ciclo exoeritrocítico do P. gallinaceum.

Susceptibilidade e resposta imune humoral do hospedeiro natural Gallus gallus domesticus a esporozoítas de Plasmodium gallinaceum (Brumpt, 1935)

Investigou-se a susceptibilidade da galinha doméstica, hospedeiro natural do Plasmodium gallinaceum (Pg), aos esporozoítas inoculados por diferentes vias, bem como a sua capacidade de produzir anticorpos anti-esporozoítas. Aves de uma ou três semanas de idade foram inoculadas com esporozoítas pela picada de Aedes Fluviatilis, pela via subcutânea (s.c.) ou intravenosa(i.v.) e as parasitemias acompanhadas através de esfregaços sanguíneos diários. Nas aves de uma semana inoculadas pela picada de Aedes ocorreu 100 por cento de infecção, enquanto nas aves de três semanas ocorreu variação de 40 a 100 por cento, proporcional ao número de fêmeas alimentadas. A inoculação de esporozoítas pela seringa resultou em 100 por cento de infecção. O período pré-patente (PPP) da malária foi menor na inoculação i.v., no entanto, a idade da ave não influenciou o PPP. Aves mais jovens tiveram maiores parasitemias e mortalidades. Nos soros coletados após a primoinoculação, anticorpos anti-esporozoítas foram detectados pela imunofluorescência indireta (IFI) nos dias 7 e 14 após inoculação, declinando na terceira semana.Na Elisa com esporozoítas isolados de mosquitos, os soros foram positivos a partir da terceira semana. Nas três reinoculações de esporozoítas, os títulos de anticorpos atingiram um platô após o segundo inóculo. As aves inoculadas pelas tr~es vias apresentaram títulos similares ao final das reinoculações, embora as que foram inoculadas pela picada apresentaram maior aumento no título de anticorpos. Pelas análises de western-blot com sedimento ou antígenos solúveis de esporozoítas, a proteína circumesporozoíta (cs) foi reconhecida pelos soros de aves inoculadas por qualquer das três vias utilizadas, a partir da segunda semana após inoculação. Outras proteínas de variados pesos moleculares foram também reconhecidas, algumas pertencentes a antígenos obtidos de Aedes não infectados, entre elas uma proteína de 7 kda.

No modelo aviário, o hospedeiro natural produziu anticorpos contra os antígenos de esporozoítas com elevados títulos e prevalência, tendo a proteína CS confirmado a sua imunogenicidade. A possível presença de anticorpos protetores nos soros de aves expostas aos esporozoítas e o estudo das diferenças qualitativas entre os esporozoítas inoculados pela picada e seringa, suas conseqüencias na interação parasita-hospedeiro e resposta imune subseqüente necessitam ser melhor estudadas no futuro.